图1 用于蛋白质纯化的HyperCel Mixed模式平台可按照流程工业生产设备的比例放大制造。

生物技术的进步也使得医药产品生产流程的要求发生了明显的改变。近年来在上游技术领域中，生产效率的提高也要求下游流程工艺技术随之发生变化，要求它们有着可持续性的优化改进。尤其是在蛋白质提纯的色谱分离方法中，对高性能的色谱分离技术有着强烈的市场需求。该领域有什么新的替代方案或者新的发展吗？本文将对此加以介绍。

单克隆抗体（Mabs）主要是利用相似性色谱分离法对蛋白质A进行提纯的。在各种临床研究的蛋白质中，目前有35％的蛋白质属于这种单克隆抗体类别。这种蛋白质A相似性色谱分离技术的一个最大缺点是：每升吸附剂的价格太高了。工业化的流程生产企业非常希望能够降低这一费用。蛋白质A的吸附要求在酸性很强的条件下完成（酸碱度pH值小于3），从而有可能引起不希望出现的腐蚀或者最终蛋白质产品的变异。除此之外还必须注意到，随着疏水层析柱使用寿命的增加，配合基也将逐渐变弱，从而在最终馏出物中又能找到蛋白质A的成分，必须再次进行分离过滤。

Mixed模式提纯

Mixed模式表示的是在样本和吸附之间相互作用的多功能滞留机制。早在1970年，实验发明家就在他们的大学实验室中发现了Mixed模式配合基，但那时距商业性的实用还有很长一段距离。但也就从那时起，情况开始慢慢地发生变化了。在流程工艺技术的研发中，Mixed模式提纯技术得到了越来越多的应用。一个很好的实例就是工业化应用的HyperCel Mixed模式的蛋白质提纯技术平台。在实践中，这种疏水层析柱的容量已经达到了几百升。

单克隆抗体的提纯

MEP－hyperCel疏水层析柱纯化技术以其量身定作的4－Mercaptoethylpyridin－配合基非常适合于与离子结合色谱分离技术组合使用，成为蛋白质A化工纯化的最佳替代方案。这些配合基含有杂环化合物的Pyridinring和Thioetherstruktur元素，它们的组合具有很高的抗体亲合力。吸附剂是专门为提纯单克隆抗体而研发的，适用于各种不同的抗体种类和子类。滞留机制的初级、也就是起始端是在中性条件下（PBS，pH值7.4）疏水交换作用。最终蛋白质产品的提纯是在酸碱度pH值适度下降的情况下，即在通过相同（正）电荷的静电排斥电场梯度意义的情况下完成的。一般来讲，酸碱度pH值的变动范围在pH 4.5和pH 4.0时就足够了，无需强酸的条件。

在充电的条件下，当蛋白质失去了正电荷时，吸附剂并没有得到正电荷而充电。酸碱度pH值降低的作用引起充电感应：由配合基的Pyridinring的质子化和蛋白质充电增强而引起的充电感应。这一机制被称之为HCIC疏水性电荷诱导层析（Hydrophobic Charge Induction Chromatography）。其结果就是前面提到的相同（正）电荷静电排斥的充电现象。当这种疏水交换作用超过其亲和力的强度时，最终目标蛋白质就会从疏水层析柱分离出来（图2）。

图2 MEP hyperCel (pKa 4.8)在建议的充电条件下（PBS，pH7.4）处于非离子化的状态。酸碱度pH值的降低，会在吸附剂上引起充电感应，引起蛋白质充电的增强。

Mixed模式的机制在实践中提供了非常重要的应用优点：例如提纯就是在前面提到的“温和的”酸碱度范围内进行，即在pH 4.5至pH 4.0之间进行的。相比较，蛋白质A提纯的典型酸碱度下降值为pH 3.0（或者更低）。在温和的提纯条件下，尤其是在抗体组提纯中有着非常诱人的重要意义：通常情况下在酸碱度pH 4.0开始就会出现腐蚀，会出现离析的倾向。

新方法的吸附剂也具有抵抗恶劣工作条件的能力（1 N NaOH，200 CIP循环），能够提高疏水层析柱的使用寿命、经济性很高。

下游产品领域中，这种高效色谱分离提纯技术的应用以可靠和快速的吸附技术研发为前提。出于这一原因，实验室尺寸比例的PRC疏水层析柱设备已经采用了Mixed模式提纯技术。用聚丙烯材料制造的层析柱（1 ml，5x50mm）能够与各种市场上常见的色谱分离系统相互连接，配套使用。它为今后按比例放大提供了基本的依据，因为吸附剂在实验室、样机和生产规模的流程设备中都能使用。生产用的疏水层析柱是对LRC系列层析柱的补充，它有着不同的内径（10mm、15mm、25mm和50mm），柱长（可达750mm床高）；也可提供下一放大比例等级（床容积达900ml）的疏水层析柱。

小结

HyperCel Mixed模式平台提供了新的、从未稀释的原材料源中获取蛋白质的选择方案。Mixed模式的吸附剂MEP HyperCel最适合于经济高效的提纯单克隆抗体。生物医药产品的生产也有了高效和经济的生产蛋白质纯化新的工具：符合流程设备生产按比例缩放制造的新工具。

效率和经济性问题

Pall生命科学有限公司欧洲生物制药中心市场经理Dirk Sievers博士强调说：色谱分离技术在生物医药产品生产工艺中属于费用最昂贵的一个工艺步骤了。因此，在医用蛋白质纯化工艺流程的研发中，经济和高效是人们关注的两个焦点。

图3 “新的色谱分离纯化技术有着提高产量的优点，但是它还有很大的改进提高的空间。”
——Dirk Sievers博士，Pall生命科学有限公司欧洲生物制药中心市场经理

PROCESS：在生物医药工程技术中，典型的医用蛋白质纯化技术方案有哪些色谱分离步骤？

Sievers博士：一般来讲，一个这样的方案包括了一系列先后衔接的色谱分离流程步骤，可粗略地分为捕获、净化和纯化过程。最先开始的是捕获过程，即通过从水中分离出含有目标蛋白质的浓缩过程。在这一过程中，目标蛋白质应在一个稳定的，无蛋白酶的环境中进行转移。除了保证色谱分离介质有很高的动态键合能力以外，速度因素还具有非常重要的意义。第二个所谓的净化步骤就是提高目标蛋白质个体的质量，保证相同结构的类似链接都可靠的断开（例如一个个单元或者混合结构）。最后一个纯化步骤是最终的提纯，也就是说清除链接的杂质（DNA、内毒素、病毒、Wirtszell蛋白）。到纯化流程的终端，目标蛋白质应该达到最高的产量和最高的纯度。

PROCESS：主要采用的有哪些色谱分离纯化技术？

Sievers博士：色谱分离纯化技术的主要种类有：AC相似性色谱分离技术，IEX离子交换色谱分离技术和HIC疏水交感色谱分离技术。它们都为提高用户的产量做出了贡献，但是也都有很大的改进提高空间。尤其是强烈增加的蛋白质成品总量和细胞结构容积的增大，迫使人们不得不转换思考问题的方法。除了流程工艺技术的考虑之外，经济性也很重要，因为色谱分离技术是整个生物工程技术中一项费用最昂贵的技术。新的生物工程技术研发的一个最重要的要求就是：在研发新技术的同时要考虑到生产效率和经济性。

PROCESS：您认为有优化改进的可能性吗？

Sievers博士：现在的色谱分离纯化技术为用户的使用提供了许多益处。但另一方面，它也有自己的弱点和不足，需要用新的方法和措施来改进提高，弥补其不足。其中包括放弃使用检测酸碱度pH值来检测目标蛋白质生物完整性的方法，减少对初级蛋白质捕获前所需的营养供给稀释剂的限制，在将蛋白质与类似特性物质（例如：疏水性能）分离时减少盐份浓度，简化再生过程（相容性1N NaOH），减少中间转换次数和降低纯化费用。